Mark Kolthoff volgt de opleiding aan de Rijksacademie voor Beeldende Kunsten. Hierin wordt veel aandacht geschonken aan anatomie en figuurtekenen. Zijn belangstelling gaat echter uit naar de kubistische schilderkunst. Omstreeks 1927 bezoekt hij Piet Mondriaan in Parijs. Hij gaat na zijn huwelijk met Hetty Wolf wonen in het voormalig pakhuis op het Rusland te Amsterdam, dat zij door Rietveld en mevr. Schröder laten inrichten. Hij verdient zijn brood met het schilderen van naturalistische portretten. Hun huis wordt een ontmoetingsplaats voor schilders, intelectuelen, fotografen en cineasten als Harry van Kruiningen, Alex de Leeuw en Hans Richter. Kolthoff ontmoet Joris Ivens die hem vraagt zijn assistent te worden. Samen met Joop Huiskens, John Fernhout, Jan Hin en Willem Bon wordt hij medewerker van de Studio Ivens, houdt zich intensief bezig met fotografie en film, waardoor het schilderen op de achtergrond raakt. Pas vanaf 1937 gaat hij weer schilderen en wordt actief lid van 'De Onafhankelijken'. Hij wordt secretaris van De Onafhankelijken in 1940. Als de Onafhankelijken zich aansluiten bij de Kultuurkamer wordt hij als niet-Arisch lid van de ledenlijst geschrapt. Hij raakt in de oorlogsjaren zijn fotografische apparatuur kwijt waarna hij nauwelijks meer fotografeert. In 1947 wordt hij docent aan de Opleiding tot Tekenleraren aan het Instituut voor Kunstnijverheidsonderwijs te Amsterdam (later de Rietveldacademie). Na zijn pensionering en verhuizing naar Nieuw-Loosdrecht kan hij zich geheel wijden aan de schilderkunst. (In 1937 is Kolthoff met filmen en fotograferen gestopt en is zich weer gaan wijden aan de schilderkunst die nog steeds zijn echte liefde had. Terugkijkend zegt hij dat de periode van bezinning misschien invloed heeft gehad op de aandacht op het bestuderen van de vorm. Hij vindt fotografie echter te zeer afwijken van de schilderkunst om er echt invloed van ondergaan te hebben. Als schilder stelde hij zich vanaf het begin vlakvulling als probleem, als fotograaf keek hij pas in de donkere kamer hoe hij het beeld moest kaderen. Het is echter opvallend dat Kolthoff aan het eind van de jaren 30, nadat hij in de fotografie geëxperimenteerd had met nieuwe perspectieven en vlakvulling, de problemen met de schilderkunst overwonnen had en kubistisch begon te schilderen).